Postersitzungen, Freitag, 30. 9. 2016

 
dt/engl
Posterkabinett 6 13:15 - 14:15 30.09.2016
Postersitzung PFr06
Retina: Grundlagen RPE // Basics RPE
Vorsitzende/r: Annette Hager (Berlin), Clemens Lange (Freiburg)

Referent/in: Jan Tode (Kiel)
Einführung und Fragestellung: Die Zunahme der Dicke der BrM ist ein bedeutender Pathomechanismus der nicht-exsudativen altersabhängigen Makuladegeneration (trockene AMD). Es gibt bis dato keine adäquate Therapie der trockenen AMD. Wir untersuchen den Effekt der sub-threshold Laserbehandlung TS-R auf AMD-typische Veränderungen im Mausmodell. Versuchstiere und Methoden: Wir behandelten 5 Augen von 5 vier Monate alten ApoE knock out Mäusen (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) mit dem TS-R Laser (Laserparameter: 532 nm Wellenlänge, continuous wave, 50 µm Spotgröße, 10 ms Bestrahlungsdauer, durchschnittlich 5,4 mW Leistung). Wir applizierten je 70 bis 100 Laserspots mit einem Interspotabstand von 2 Spots. Die Leistung wurde auf 70 % unterhalb der klinischen Sichtbarkeit eingestellt. Das jeweilige Partnerauge diente als Kontrolle. Alle 10 Augen wurden mittels Funduskopie, optischer Kohärenztomographie (OCT) und Fluoreszeinangiographie (FLA) am Tag der Behandlung sowie 1 Tag und 1 Monat nach der Behandlung untersucht. Wir enukleierten die Augen 1 Monat nach der Behandlung und analysierten verblindet und standardisiert die Dicke der BrM im Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Ergebnisse: In den Fundusaufnahmen zeigten sich bei allen ApoE knock out Mäusen AMD assoziierte Veränderungen wie Drusen und hypopigmentierte Bereiche des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Drusen waren ebenfalls im OCT sichtbar. Die FLA zeigte keine pathologischen Veränderungen. Die subthreshold TS-R Laserspots waren weder nach 2 Stunden, noch nach 1 Tag oder einem Monat in der Funduskopie, der OCT oder der FLA zu sehen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Anzahl der Drusen im behandelten Auge vor der TS-R (Mittelwert 4, ± 4) und 1 Monat nach der TS-R (Mittelwert 7, ± 3) oder verglichen mit dem Partnerauge (Mittelwert 5, ± 2). In der TEM war ein signifikanter Unterschied (p< 0,001) der Dicke der BrM zwischen dem TS-R behandelten Auge (Mittelwert 524,8 nm, SEM 11,4 nm) und dem Partnerauge (Mittelwert 585,7 nm, SEM 12,9 nm) zu sehen. Die BrM aller behandelten Augen war dünner als die BrM der Partneraugen. Schlussfolgerungen: Thermische Stimulationstherapie der Retina TS-R führt zur Abnahme der Dicke der BrM in ApoE knock out Mäusen ohne die Neuroretina zu schädigen. TS-R könnte eine Therapieoption für die trockene AMD darstellen.
Referent/in: Susanne Wasmuth (Münster)
Fragestellung: Verglichen mit dem Rest des Körpers enthalten Retina und retinales Pigmentepithel (RPE) sehr hohe Zinkkonzentrationen. Bei AMD-Patienten ist der okuläre Zinkspiegel verringert und die RPE-Zellen degenerieren, während das Komplementsystem verstärkt aktiviert ist. Um Einblick in dieses Zusammenspiel zu gewinnen, wurde der Einfluss von Komplementserum auf Zink-supplementierte RPE-Zellen untersucht. Methodik: Humane ARPE-19 Zellen als RPE-Zellmodell wurden mit ansteigenden Konzentrationen Zinksulfat oder Zinkchlorid alleine und kombiniert mit humanem Komplementserum (HKS) inkubiert. Kontrollen erhielten hitze-inaktiviertes HKS, C7-defizientes Serum oder bovines Serumalbumin (BSA). Die Viabilität wurde durch die Konversion von Thiazolylblau und die Aufnahme von Propidiumiodid gemessen. Verschiedene RPE-Zellpopulationen wurden mit Hoechst und Hämatoxylin gefärbt. In den Zellkulturüberständen wurde der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ermittelt. Die Sekretion von Interleukin (IL)-6, IL-8, des Chemokins MCP-1 und des Gefäßwachstumsfaktors VEGF wurde im Sandwich ELISA bestimmt. Ergebnisse: Überstiegen die Konzentrationen der Zinkverbindungen 150 µM, wurde eine deutlich verringerte Viabilität nach einer Zugabe über 24 Stunden beobachtet. Alle Seren – auch HKS – schwächten die Toxizität von hochdosiertem Zink ab, während BSA weniger effektiv schützte. Nach 48 Stunden zeigten die HKS-behandelten RPE-Zellen eine schlechtere Morphologie als die mit den Kontrollseren behandelten RPE-Zellen. Es fanden sich tendenziell mehr ROS durch die Behandlung mit HKS, aber auch durch alleinige höhere Zinkkonzentrationen. Die Sekretion von Zytokinen und VEGF wurde durch HKS verstärkt, blieb aber durch Zink eher unverändert. Zinkkonzentrationen von 25-50 µM wurden über mehrere Wochen hinweg gut toleriert und wirkten sich weder auf Morphologie noch Viabilität aus. Schlussfolgerungen: Die Degeneration von zinkreichen RPE-Zellen bei AMD könnte die retinale Mikroumgebung durch Freiwerden dieses Spurenelements verändern. Die initial beobachtete Schutzfunktion von HKS und anderen Seren war nur teilweise auf die unspezifische Bindung von potenziell toxischen freien Zink-Ionen an Serumproteine wie Albumin zurückzuführen. Die verstärkte Produktion von ROS deutet auf eine Stressantwort der RPE-Zellen durch Zink und Komplement hin. Erst bei längeren Inkubationsperioden waren Unterschiede zwischen HKS und den Kontrollseren bei hohen Zinkkonzentrationen sichtbar.
Referent/in: Daniel Kampik (Würzburg)
Fragestellung: Am Beginn aller Formen der altersbedingten Maculadegeneration steht eine Dysfunktion des retinalen Pigmentepithels mit Zellverlust. Wir untersuchten die Möglichkeit, mittels Überexpression des Zellzyklus-regulierenden Transkriptionsfaktors E2F2 eine Regeneration im RPE zu erzielen. Methodik: Wildtyp C57BL6/J Mäuse erhielten subretinale Injektionen des nicht-integrierenden lentiviralen Vectors LNT-E2F2, als Kontrolle diente LNT-GFP. Überexpression des Transgens wurde 10 Tage später durch Immunfluoreszenz an RPE-Flatmounts nachgewiesen, BrdU diente als Proliferationsmarker. Die RPE-Zelldichte wurde anhand der ZO-1-markierten Zellgrenzen bestimmt. In transgenen RPECreER/DTA-Mäusen kann Diphterie-Toxin-A (DTA)-Expression selektiv im RPE induziert werden. Ergebnisse: LNT-E2F2 bewirkte eine 40±27-fache Zunahme (Medium±Standardabweichung) der E2F2-positiven RPE-Nuclei, ebenso eine 10 ±5-fache Erhöhung der BrdU-positiven Nuclei. Dies galt sowohl für junge (12 Wochen alt) wie für alte (18 Monate) Mäuse. Die RPE-Zelldichte steigerte sich um 17±12% im Vergleich zum Kontrollvektor (p=0,0011), um 14±7% im Vergleich zu unbehandelten Augen (p=0,0071, n=15 Augen pro Gruppe). Dieses Konzept wurde in einem Mausmodell getestet. Nach Aktivierung des DTA-Toxins in RPECreER/DTA-Mäusen zeigte sich eine 24 ±10%ige Reduktion der Zelldichte im RPE-Zentrum nahe des N. opticus, wo die RPE-Pathologie am auffälligsten war. LNT-E2F2 führte zu einer 9±3-fachen Erhöhung der BrdU-Aufnahme sowie zu einer Erhöhung der RPE-Zelldichte um 35±12% im Zentrum (p=0,0458, n=4 Augen pro Gruppe). Schlussfolgerung: E2F2-Überexpression induziert RPE-Proliferation und erhöht die Zelldichte in vivo, gerade wenn die RPE-Zelldichte pathologisch reduziert ist. Dies könnte therapeutisch für eine RPE-Regeneration in situ genutzt werden.
Referent/in: Martin Busch (Münster)
Fragestellung: ARPE-19-Zellen sind ein Modell für retinales Pigmentepithel (RPE) und reagieren auf die Stimulation durch Komplement und UV-Licht-bestrahlte Photorezeptoraußensegmente (UV-POS) mit pro-inflammatorischen und pro-angiogenen Veränderungen, wie sie bei der AMD-Pathogenese eine Rolle spielen könnten. Das Ziel dieser Studie war, auf der Grundlage von Proteomanalysen mögliche intrazelluläre Signalwege zu identifizieren, die diese funktionellen Veränderungen der ARPE-19-Zellen vermitteln. Methodik: Zur Komplementstimulation wurden ARPE-19-Zellen für 24 Stunden in DMEM/F12-Medium inkubiert, dem 5 % humanes Komplementserum (HKS) zugesetzt war. Das Medium allein oder der Zusatz von 5 % hitzeinaktiviertem HKS (HI-HKS) oder von C7-defizientem HKS dienten als Kontrollen. Zusätzlich wurden 2 Gruppen von Zellen über den Zeitraum von einer Woche 3x mit 10 µg/ml UV-POS vorbehandelt. Danach wurden die Zellen gewaschen und für die letzten 24 Stunden mit Medium oder 5 % HKS-haltigem Medium inkubiert. Die Proteine der Zellen wurden mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Differentiell auftretende Spots wurden exzidiert, aus dem Gel eluiert und mittels MALDI-TOF massenspektroskopisch bestimmt. Ergebnisse: In zwei unabhängigen Experimenten wurden verschiedene Proteinspots gefunden, die bei den unterschiedlichen Behandlungsgruppen differentiell exprimiert waren. Aus beiden Experimenten wurden insgesamt 27 Proteinspots durch das MALDI-TOF-Verfahren analysiert. Dabei wurden 56 verschiedene Proteine identifiziert, die 7 funktionellen Gruppen zugeordnet werden konnten (metabolisch (12), strukturell (16), globulär (3), assoziiert mit Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion (2), Genexpression (4), Entzündung und Angiogenese (7) und Signaltransduktion (10). 60 % der identifizierten Signaltransduktions-Proteine sind mit Reaktionen auf zellulären und oxidativen Stress assoziiert. Bis auf zwei Ausnahmen traten diese Proteine bei Stimulation mit HKS, UV-POS oder deren Kombination auf. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse zeigen, dass die Stimulation mit Komplement und UV-POS das Proteom von ARPE-19-Zellen verändert. Weitere Experimente sind erforderlich, um zu klären, inwieweit die identifizierten, differentiell exprimierten Signaltransduktions-Proteine an der Vermittlung der funktionellen Veränderungen von ARPE-19-Zellen in Reaktion auf Komplementstimulation und UV-POS beteiligt sind.
Referent/in: Joshua Patt (Bonn)
Fragestellung: Aktuelle Studien beschreiben eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms im RPE von Patienten mit AMD. Die Inflammasom-Aktivierung resultiert in einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β, die abhängig u.a. vom Zelltyp entweder durch aktive Sekretion oder durch passive Freisetzung im Rahmen einer Zelllyse (Pyroptose) erfolgen kann. Wir haben den Mechanismus der IL-1β-Freisetzung in RPE-Zellen untersucht. Methodik: In primären humanen RPE-Zellen (pRPE) und ARPE-19-Zellen wurde das Inflammasom nach Priming mit IL-1α durch verschiedene Stimuli (Lipofuszin-Phototoxizität, Leu-Leu-OMe, ATP, Nigericin) in ansteigenden Dosierungen aktiviert. Anschließend erfolgte eine parallele Quantifizierung von IL-1β-Freisetzung und Zelllyse (LDH-Freisetzung). Ergebnisse: Für die verschiedenen Stimuli wurden Dosis-Wirkungs-Kurven der Inflammasom-Aktivierung bestimmt. Unabhängig von Art und Dosierung des Stimulus‘war eine Freisetzung von IL-1β in ARPE-19-Zellen ausschließlich in Assoziation mit einer gleichzeitigen Zelllyse nachweisbar. Ergebnisse einer Überprüfung dieser Befunde in pRPE-Zellen werden ebenfalls präsentiert. Schlussfolgerungen: Die Inflammasom-gesteuerte Freisetzung von IL-1β durch RPE-Zellen in vitro erfolgt ausschließlich durch Zelllyse im Rahmen von pyroptotischem Zelltod, nicht durch aktive Sekretion von lebenden Zellen. Eine Beteiligung der Inflammasom-Aktivierung im RPE an der AMD-Pathogenese erscheint somit vor allem im atrophen Spätstadium der Erkrankung möglich, in dem der Untergang von RPE-Zellen im Vordergrund steht.
Referent/in: Lukas Willmann (Würzburg)
Fragestellung: Das amitotische retinale Pigmentepithel (RPE) kann durch stimulierende Prozesse zur Proliferation angeregt werden. So führt eine erhöhte Expression des Zellzyklus-regulierenden Transkriptionsfaktors E2F2 zur Proliferation und zu einer Erhöhung der Zelldichte in vivo. Um diese Mechanismen im Rahmen der Regeneration des RPE nutzen zu können, testeten wir Vitalität, Apoptose, Barrierefunktion und epithelial-mesenchymale Transition (EMT) in vitro. Methodik: ARPE-19 Zellen auf 0,4µm Transwell-Filtern wurden in nährstoffarmem Medium belassen bis zum Wachstumsarrest durch Kontaktinhibition. Transfektion mit pCMV-E2F2 bewirkte E2F2-Überexpression (Kontrolle: Leer-Plasmid pCMV-Neo-Bam). Apoptotse wurde mit TUNEL, Zellvitalität mit XTT-Test untersucht, die Barrierefunktion durch einen FITC-Dextran Assay (4kD) erfasst und spektrophotometrisch quantifiziert. EMT wurde durch immunhistochemische Färbung bzw. Western Blot von EMT-Markern überprüft. Ergebnisse: Der Anteil TUNEL positiver Zellen erhöhte sich 2 Tage nach E2F2-Transfektion um das 3-fache, nach 2 Wochen sank er auf das Niveau der Kontrollgruppe. Der Vitalitätsverlust (XTT-Test) betrug am ersten Tag nach Transfektion im Vergleich zur nicht transfizierten Kontrolle 33,5%. Ab dem 7. Tag erreichten die transfizierten Zellen fast das Vitalitätsniveau der nicht transfizierten (< 5%). Die Permeabilität des Monolayers für FITC-Dextran nahm in den ersten 3 Tagen nach Transfektion mit E2F2 um 7,2% zu und erreichte ab dem 7. Tag wieder das Niveau der Kontrollgruppe. Bezüglich der EMT Marker N-Cadherin, β-Caterin und α-SMA zeigten sich keine Unterschiede zur nicht transfizierten Kontrollgruppe. Fibronectin und Collagen IV konnten, anders als bei der TGF-β2-Positiv-Kontrolle, 1 Woche nach Transfektion im WB nicht nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Transfektion von E2F2 zur Proliferationssteigerung führt im RPE-in vitro-Modell zwar kurzfristig zu signifikanter Vitalitätsminderung, Apoptose und Verlust der Barrierefunktion. Diese Parameter erholen sich jedoch binnen 1-2 Wochen (fast) vollständig. E2F2 verursacht zudem keine signifikante EMT. Zur Überprüfung des Konzepts sind weitere in vivo Studien anzustreben.
Referent/in: Katharina Kern (Lübeck)
Fragestellung: Subletale Hyperthermie wird derzeit als Strategie zur Verbesserung der Zellfunktionalität des retinalen Pigmentepithels (RPE) diskutiert. Ziel dieser Arbeit ist es, die Wirkung von thermischer Stimulation auf die Expression von HSP (Heat Shock Protein) 70 und die Auswirkungen der Inhibition dieses Protein auf die Vitalität von RPE-Zellen zu untersuchen. Methodik: Primäre porzine RPE-Kulturen wurden als Modell genutzt. Zur thermischen Stimulation wurden die Zellkulturen in der P2-Generation in einer 30 mm Kulturschale mittels Thuliumlaser (λ= 1940 nm) für 10 Sekunden bestrahlt. Die Temperaturverteilung verlief annähernd gaussförmig, wobei die maximal erreichbare Temperatur Tmax im zentralen Bereich der Zellkultur anlag. Durch unterschiedlich eingestellte Leistungen wurden Tmax-Temperaturen von subletal (Tmax: 40-46°C) und letal (Tmax: 50-58°C) ausgewählt. 3 und 24 Stunden nach der Bestrahlung wurden Zelltod- und Proliferationsraten, sowie die intrazelluläre Konzentration an HSP70 mittels Western Blot und Immunzytochemie beurteilt. Die Funktionalität von HSP70 wurde über die Gabe von VER-155008 (25 µM), einem ATP-Derivat, inhibiert und die Auswirkungen auf den Zelltod und die Vitalität untersucht. Ergebnis: Intrazelluläre Mengen an HSP70 stiegen nach der Bestrahlung auf letale Temperaturen (Tmax≥ 50°C) drastisch um bis zu 500% an, wohingegen subletale Temperaturen (Tmax≤ 46°C) zu einem moderaten Anstieg der intrazellulären HSP70-Konzentration um 200% führten. Immunzytochemie gab Hinweise auf distinkte Temperaturbereiche in denen es zu einer Überexpression von HSP70 kommt (40-43°C). VER-155008 erhöhte MTT-Werte in unbestrahlten Kontrollzellen (114% und 115% nach 3 und 24 Stunden) und führte bei den bestrahlten Zellen zu einer deutlichen Senkung der Schwellenwert-Temperatur für Zelltod nach 3 und 24 Stunden. Die MTT-Werte nach Gabe von VER-155008 war in den subletal bestrahlten Zellen (Tmax 43°C) niedriger (94%) als in der unbestrahlten Kontrolle nach 24 Stunden. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, dass eine Expression des induzierten HSP70 in relativ milden Temperaturbereichen hervorgerufen wird. Des Weiteren deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Funktionalität von HSP70 entscheidend für die zellulären Überlebensstrategien nach Erwärmung ist. Eine Ursache für die Erhöhung der MTT-Werte ist mitochondrialer Stress und subletale Hyperthermie scheint das Potential zu besitzen Signalwege zu aktivieren, die diesen Stress reduzieren könnten.
Referent/in: Nil Celik (Heidelberg)
Fragestellung: Wir stellten bereits ein neues Tool für die automatische Analyse von Lipofuszingranula (LG) in retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen in hochaufgelösten 3D-Bildern mittels strukturierter Beleuchtung (SIM) vor. In einer zusätzlichen Analyse, untersuchten wir nun Melanolipofuszingranula (MLG). Methodik: LG und MLG wurden in 3D-SIM Bildern (Anregungswellenlänge 488, 568 und 647 nm) untersucht. Die automatische Analyse identifiziert und quantifiziert die Anzahl, Größe und Position einzelner Granula in RPE-Flatmounts. Die LG und MLG eines 88jährigen Spenders wurden in der makulären Region quantifiziert. Ergebnisse: Von 541 Granula wurden 411 (76,0%) als LG und 130 (24,0%) als MLG identifiziert. LG und MLG waren besonders am Zellrand verteilt. Schlussfolgerungen: LG und MLG sind mittels SIM hochauflösend darstellbar. Beide Granulaarten können voneinander unterschieden sowie bzgl. ihrer Anzahl und Position innerhalb der Zelle quantifiziert werden. Quantitative Daten über die Charaktereigenschaften von autofluoreszenten Granula tragen dazu bei zelluläre Prozesse innerhalb des RPE besser zu verstehen.
Referent/in: Margrit Hollborn (Leipzig)
Purpose: Systemic hypertension is a risk factor of AMD, a chronic inflammatory disease. Acute hypertension is caused by increased extracellular osmolarity resulting from the intake of dietary salt (NaCl). The aim of the study was to determine in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells whether high extracellular NaCl alters the gene expression of inflammasome-associated proteins, and whether autocrine/paracrine purinergic (P2) receptor signaling contributes to the NaCl-induced NLRP3 gene expression. Methods: Extracellular hyperosmolarity was induced by addition of 100 mM NaCl or 200 mM sucrose to the culture medium. Gene and protein expression levels were determined with real-time RT-PCR and Western blot analysis, respectively. Cytosolic IL-1β level was evaluated with ELISA. Results: High (+ 100 mM) extracellular NaCl induced NLRP3 and pro-IL-1β gene expression, while the gene expression of further inflammasome-associated proteins (NLRP1, NLRP2, NLRP6, NLRP7, NLRP12, NLRC4, AIM2, ASC, procaspase-1, pro-IL-18) was not altered or below the detection threshold. The effect of high NaCl on NLRP3 gene expression was dose-dependent, with significant increases above 10 mM added to the medium. The NLRP3 mRNA level was also increased in the presence of 200 mM sucrose. The NaCl-induced NLRP3 gene expression was partially dependent on the activities of phospholipase C, IP3 receptors, protein kinase C, the serum and glucocorticoid-regulated kinase, p38 MAPK, ERK1/2, JNK, PI3K, and the transcription factors HIF-1 and NFAT5. Pannexin-dependent ATP release and P2Y1 receptor activation is required for the full induction of NLRP3 gene expression. High NaCl induced a transient increase in the level of the cytosolic NLRP3 protein and a moderate NLRP3 inflammasome activation, as indicated by the increase of the cytosolic level of mature IL-1β. Conclusions: The data suggest that high extracellular NaCl induces priming of RPE cells for NLRP3 inflammasome activation, in part via P2Y1 receptor signaling. The priming effect of NaCl for inflammasome activation suggests that high intake of dietary salt may promote local retinal inflammation implicated in the development of AMD.
Referent/in: Kai Januschowski (Tübingen)
Introduction: Vital dyes have become a clinical standard during vitrectomy to visualize anatomical structures. It was the aim to test the effect of two vital dyes (AV-17 and MBB Dual) on different intraocular cells. Methods: Cell morphology was assessed via phase contrast pictures, cell viability via MTS assay and total cell amount via crystal violet staining. ARPE19 and 661W cells were chosen for toxicology testing and an exposure time of 60 seconds, 15 minutes and 30 minutes was chosen. Vital dyes were completely removed after the staining period. Results: Treatment with AV17 changed the morphology and the cell number at every time-point investigated on ARPE 19 and 661 W cells. Cell viability of ARPE19 cells treated with AV 17 or MBB Dual showed only a slight or no decrease in cell viability after the three different exposure times. AV 17 without medium to stimulate a possible intraoperative use under air showed a decrease of viability of 6 %, 24 % (p< 0.01) and 14 %. A difference of cell density of 21 %, 46 % (p < 0.01) and 34 % (p< 0.001) was noted during crystal violet staining for AV 17, MBB Dual showed a decrease of 2%, 16% and 3 % after 30 minutes compared to BSS. MTS showed a cell viability of 661W cells treated with AV 17 of 16 %, 29 % and 34 % (p< 0.05), for MBB Dual, 30 % (p< 0.001), 28 % and 28 % (p< 0.001) respectively. AV 17 directly applied decreases the viability significantly of 18 % after 60 seconds (p< 0.01), 33 % (p< 0.001) and 40 % after 30 minutes (p< 0.001). Dell density of 661W via exposed relevant negative effects: incubation with AV 17 lowered the cell amount significantly by 41% (p< 0.001), MBB Dual a reduction of 12% displayed by crystal violet staining (p< 0.01). After 15 minutes a loss of 48% cell amount was detected with AV 17 (p< 0.001) and 37 % with MBB Dual (p< 0.001). 30 minutes induced the strongest effect and led to a significant reduction of 51 % with AV 17 (p< 0.001) and 28 % with MBB Dual (p< 0.001 A significant reduction of cell amount results also from direct incubation of 661W with AV 17 without any medium. AV 17 caused a reduction of 16%, 40% (p< 0.001) and 47% (p< 0.001). Conclusion: AV 17 with 5 % mannitol has a negative effect on different ocular cells.
Referent/in: Kai Januschowski (Tübingen)
Introduction: To characterize the biophysical properties of an artificial vitreous body substitute (VBS) consisting of a highly biocompatible, naturally cross-linked, hyaluronic acid (HA)-based hydrogel by analyzing its influence on intraocular pressure (IOP) and retinal integrity in distinct ex-vivo eye models. Methods: Pig eyes were obtained immediately post mortem and VBS injected after vitrectomy. IOP was followed for 24 h (n=5). VBS influence on retinal integrity was investigated using isolated bovine retinas perfused with an oxygen saturated nutrient solution. An electroretinogram (ERG) was recorded using silver/silver chloride electrodes; after application of VBS for 2 min, a washout period of 70 minutes followed. The percentage of a-and b-wave reduction at the end of the washout phase was compared to baseline values (n=5). Results: IOP increased non-significantly by 10% after 24 h. Short-term biocompatibility testing using isolated superfused bovine retinas neither showed significant reductions of the b-wave nor the a-wave amplitudes (b-wave reduction 14.2%, p>0.05; a-wave reduction 23.9 %, p>0.05). Conclusion: The manufactured HA-based hydrogel showed highly favorable biophysical characteristics in the explored ex vivo models suggesting its further application as a vitreous substitute in vivo.
Referent/in: Katharina Neuer (München)
Fragestellung: Ziel dieser Arbeit war die in vitro Untersuchung der Verträglichkeit des Silikonöls Siluron Xtra® auf porkiner Netzhaut in einem Perfusionssystem. Methodik: Das Netzhautgewebe vom 37 Schweineaugen wurde unmittelbar post mortem präpariert und für einen Zeitraum von 4-8 Tagen mit flüssigem Kulturmedium in einem Perfusionssystem (Minucell) perfundiert. In den Perfusionskammern wurden 23 der neurosensorischen Netzhautproben mit anliegendem retinalen Pigmentepithel (RPE) mit dem Silikonöl bedeckt (Versuchsgruppe 1). Eine Kontrollgruppe mit 7 Proben wurde ohne Silikonöl perfundiert (Versuchsgruppe 2). In der 3. Versuchsgruppe wurde das RPE von 7 Proben ohne sensorische Netzhaut mit Silikonöl bedeckt und perfundiert. Hiermit sollte in vitro ein Netzhautriss imitiert werden, wobei Silikonöl ebenfalls in direktem Kontakt mit RPE stünde. Die Morphologie der Netzhaut und des RPE wurde lichtmikroskopisch und nach immunohistochemischer Färbung beurteilt. Hierfür wurden strukturelle Schäden an den Müller’schen Stützzellen anhand von glial fibrillary acidic portein (GFAP) untersucht. Der immunohistochemische Marker Ki67 wurde verwendet um Proliferation im RPE nachzuweisen. Ergebnisse: Mit der Ki67 Färbung zeigten sich signifikant (p=0,001) weniger Proliferation im mit Silikonöl perfundierten Netzhautgewebe (Versuchsgruppe 1) im Vergleich zur Kontrollgruppe 2. In Versuchsgruppe 3 zeigte der direkte Kontakt des Silikonöls mit RPE keine signifikante Zunahme der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle (p=1). Die GFAP Färbung ergab keine signifikanten Ergebnisse die auf eine Schädigung der Müller’schen Stützzellen im Zusammenhang mit dem Silikonöl hindeuten würden. Bei der Hämtoxylin Eosin Färbung der Gewebeproben waren in der lichtmikroskopischen Beurteilung keine morphologischen Schäden erkennbar. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse der in vitro Untersuchung bestätigen eine gute Biokompabilität des Silikonöls Siluron Xtra® auf porkine Netzhaut und RPE. Darüber hinaus konnte ein möglicher Proliferationsschutz des Silikonöls auf die Retina nachgewiesen werden. Weitere in vitro Untersuchungen sind notwendig um einen protektiven Vorteil des Silikonöls Siluron Xtra® auf die Proliferation im Netzhautgewebe zu bestätigen.
Referent/in: Sabrina Bohnacker (München)
Fragestellung: Ziel dieser Arbeit war die in vitro Untersuchung der Verträglichkeit des Silikonöls Siluron Xtra® auf porkiner Netzhaut in einem Perfusionssystem. Methodik: Das Netzhautgewebe vom 37 Schweineaugen wurde unmittelbar post mortem präpariert und für einen Zeitraum von 4-8 Tagen mit flüssigem Kulturmedium in einem Perfusionssystem (Minucell) perfundiert. In den Perfusionskammern wurden 23 der neurosensorischen Netzhautproben mit anliegendem retinalen Pigmentepithel (RPE) mit dem Silikonöl bedeckt (Versuchsgruppe 1). Eine Kontrollgruppe mit 7 Proben wurde ohne Silikonöl perfundiert (Versuchsgruppe 2). In der 3. Versuchsgruppe wurde das RPE von 7 Proben ohne sensorische Netzhaut mit Silikonöl bedeckt und perfundiert. Hiermit sollte in vitro ein Netzhautriss imitiert werden, wobei Silikonöl ebenfalls in direktem Kontakt mit RPE stünde. Die Morphologie der Netzhaut und des RPE wurde lichtmikroskopisch und nach immunohistochemischer Färbung beurteilt. Hierfür wurden strukturelle Schäden an den Müller’schen Stützzellen anhand von glial fibrillary acidic portein (GFAP) untersucht. Der immunohistochemische Marker Ki67 wurde verwendet um Proliferation im RPE nachzuweisen. Ergebnisse: Mit der Ki67 Färbung zeigten sich signifikant (p=0,001) weniger Proliferation im mit Silikonöl perfundierten Netzhautgewebe (Versuchsgruppe 1) im Vergleich zur Kontrollgruppe 2. In Versuchsgruppe 3 zeigte der direkte Kontakt des Silikonöls mit RPE keine signifikante Zunahme der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle (p=1). Die GFAP Färbung ergab keine signifikanten Ergebnisse die auf eine Schädigung der Müller’schen Stützzellen im Zusammenhang mit dem Silikonöl hindeuten würden. Bei der Hämtoxylin Eosin Färbung der Gewebeproben waren in der lichtmikroskopischen Beurteilung keine morphologischen Schäden erkennbar. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse der in vitro Untersuchung bestätigen eine gute Biokompabilität des Silikonöls Siluron Xtra® auf porkine Netzhaut und RPE. Darüber hinaus konnte ein möglicher Proliferationsschutz des Silikonöls auf die Retina nachgewiesen werden. Weitere in vitro Untersuchungen sind notwendig um einen protektiven Vorteil des Silikonöls Siluron Xtra® auf die Proliferation im Netzhautgewebe zu bestätigen.